迄今為止，文獻(xiàn)報(bào)道的許多類(lèi)器官都是在Matrigel中培養(yǎng)的。Matrigel來(lái)源于Engelbreth Holm-Swarm小鼠肉瘤細(xì)胞的分泌物，制備工藝簡(jiǎn)單，成本低廉，在3D細(xì)胞培養(yǎng)中得到了廣泛的應(yīng)用。而蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果表明，Matrigel含有1800多種蛋白質(zhì)，——由此可以看出，Matrigel成分復(fù)雜，這大大加劇了類(lèi)器官結(jié)構(gòu)和功能研究的難度。此外，Matrigel的批次不穩(wěn)定也使類(lèi)器官實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性大打折扣。與此同時(shí)，出于免疫原性的考慮，動(dòng)物來(lái)源的Matrigel在疾病建模和臨床研究中的應(yīng)用也受到了限制?；谏鲜鲈?，對(duì)既能滿(mǎn)足類(lèi)器官培養(yǎng)要求、又能滿(mǎn)足臨床研究要求的新型基質(zhì)的需求越來(lái)越多。而無(wú)異源基質(zhì)膠正是滿(mǎn)足這些要求的理想選擇。

無(wú)異源基質(zhì)膠是由溶解的人源組織制備的細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠（ECM）。在制備過(guò)程中，保留了天然組織的部分生物學(xué)活性，促進(jìn)了其中培養(yǎng)的類(lèi)器官的結(jié)構(gòu)和功能重塑。此外，這類(lèi)水凝膠保留了細(xì)胞外微環(huán)境的組織特異性，相比Matrigel，可以更好支持各種組織來(lái)源細(xì)胞的生長(zhǎng)；其源于人源組織的特性，也大大減少了臨床應(yīng)用中的免疫原性問(wèn)題。無(wú)異源基質(zhì)膠的這些優(yōu)點(diǎn)，使其具有重要的臨床應(yīng)用優(yōu)勢(shì)，進(jìn)而大大推動(dòng)再生醫(yī)學(xué)技術(shù)和組織工程的進(jìn)步。

人源ECM的凝膠化和表征

首先驗(yàn)證HumaMatrix（一種源自人源的細(xì)胞外基質(zhì)）在遵循凝膠化方案時(shí)可以成功地制備成水凝膠，首先用HCl 溶液溶解HumaMatrix粉末，用NaOH調(diào)節(jié)pH 至中性，靜置到接近生理溫度。實(shí)驗(yàn)組的人源 ECM 水凝膠在不同濃度（3、4、5、6、7 和 8 mg/mL）下都制備成水凝膠；用三個(gè)批次的HumaMatrix在8 mg/mL的濃度下，約 30 分鐘都制備成水凝膠。

圖1. 不同濃度的人源ECM形成水凝膠

其次，去細(xì)胞化和凝膠化的處理方法，有效保留了人源ECM成分，如膠原蛋白、彈性蛋白，且仍含有糖胺聚糖。與傳統(tǒng)3D培養(yǎng)系統(tǒng)（例如Matrigel）相比，人源ECM基質(zhì)膠所含成份和三維結(jié)構(gòu)明顯不同。為進(jìn)一步研究HumaMatrix的結(jié)構(gòu)，進(jìn)行掃描電鏡分析。

圖2. 顯示HumaMatrix的掃描電鏡 (SEM) 圖像

人源ECM對(duì)血管生成的影響

血管生成的測(cè)定。根據(jù)體外血管生成測(cè)定的歷史金標(biāo)準(zhǔn)方法，我們比較了分別用Matrigel和hPM（一種源自胎盤(pán)的人類(lèi)細(xì)胞外基質(zhì)）誘導(dǎo)的微血管網(wǎng)絡(luò)（圖 3C）。首先將EC培養(yǎng)物用Matrigel或hPM來(lái)培養(yǎng)，然后使用Calcein AM檢測(cè)以確定活性和網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。培養(yǎng)1天后，Matrigel包被的孔板上顯示HUVEC形成明確的血管生成小管網(wǎng)絡(luò)，但在 3 天后，相同的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)塌陷成凋亡細(xì)胞的球形球（圖3A、3C）。雖然在hPM誘導(dǎo)的網(wǎng)絡(luò)中出現(xiàn)一些細(xì)胞死亡，且在延長(zhǎng)培養(yǎng)5天后沒(méi)有觀(guān)察到細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。在血管生成的晚期，EC募集平滑肌細(xì)胞 (SMC) 以穩(wěn)定生長(zhǎng)的微血管。按照同樣的方法評(píng)估了hPM和Matrigel對(duì)平滑肌細(xì)胞形態(tài)的影響。有趣的是，在沒(méi)有HUVEC的情況下，接種到Matrigel上的SMC在1天后形成小管，但在hPM涂層板上，SMC保持典型的“山丘和山谷"形狀（圖 3D），表明細(xì)胞類(lèi)型之間的分子信號(hào)通路存在顯著差異 【1】 。

圖3. 在hPM 和 Matrigel 包被的組織培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的體外血管生成網(wǎng)絡(luò)【1】

人源ECM支持hiPSC三系分化

hiPSCs 來(lái)源于多種類(lèi)型的人原代細(xì)胞，包括新生兒包皮成纖維細(xì)胞、成人真皮成纖維細(xì)胞和成人成骨細(xì)胞。在多譜系分化之前，使用Tra-1-81對(duì)未分化的人多能干細(xì)胞進(jìn)行ICC（圖 4a）。如圖所示，hiPSCs批次顯示Tra-1-81的清晰表達(dá)。hiPSC 分為三個(gè)階段以分化出目標(biāo)譜系（圖 4b）。在EB形成期間，hiPSC先轉(zhuǎn)化為特定的譜系；在第二階段，EB在各種基質(zhì)上發(fā)生了附著、生長(zhǎng)和成熟；最終，細(xì)胞在第三階段成熟和擴(kuò)增以完成向目標(biāo)譜系的分化【2】。

圖4. hiPSC 細(xì)胞系的表征和分化示意圖【2】

人源ECM用于藥物篩選

hPM除了應(yīng)用在再生醫(yī)學(xué)中，還能用于體外篩選血管生成相關(guān)藥物【1】。同時(shí)也測(cè)試了HumaMatrix培養(yǎng)的腸癌類(lèi)器官篩選相關(guān)藥物的能力，Matrigel已被廣泛用作體外篩選抗血管生成癌癥藥物的模型和癌癥類(lèi)器官模型，因此用Matrigel作為對(duì)照。圖5通過(guò)比較用TSP-1處理的Matrigel或hPM培養(yǎng)的EC（內(nèi)皮細(xì)胞）生長(zhǎng)情況來(lái)評(píng)估藥物對(duì)血管生成的抑制作用。其中，TSP-1是一種對(duì)血管生成和新血管形成有抑制活性的糖蛋白，是實(shí)體瘤抗血管生成治療的常規(guī)用藥【1】。我們?cè)O(shè)計(jì)類(lèi)似實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HumaMatrix培養(yǎng)的腸癌類(lèi)器官在藥物篩選中的表現(xiàn)。通過(guò)比較Matrigel或HumaMatrix培養(yǎng)的腸癌類(lèi)器官經(jīng)過(guò)不同濃度的Regorafenib處理后的生長(zhǎng)狀況，評(píng)估類(lèi)器官對(duì)不同藥物的敏感性（如圖6）。

圖5. 使用基于hPM的血管生成實(shí)驗(yàn)來(lái)篩選抗血管生成腫瘤抑制蛋白TSP-1【1】

圖6. 使用不同濃度的Regorafenib處理腸癌類(lèi)器官來(lái)檢測(cè)類(lèi)器官對(duì)藥物的敏感性。

人源ECM的組織相容性

當(dāng)皮下注射到SD大鼠體內(nèi)，在生理pH條件下，hPM就會(huì)形成水凝膠。注射后20分鐘內(nèi)，在注射位點(diǎn)皮膚下方會(huì)出現(xiàn)一個(gè)腫塊。注射hPM的SD大鼠沒(méi)有出現(xiàn)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，例如紅斑腫脹和積液。注射后1周對(duì)植入物的組織學(xué)評(píng)估顯示，在所有注射hPM的動(dòng)物中，細(xì)胞浸潤(rùn)反應(yīng)增加。同時(shí)，觀(guān)察到輕微的單核細(xì)胞浸潤(rùn)反應(yīng)，主要表明淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的參與（圖7A-F）。此外，還觀(guān)察到梭形細(xì)胞，這說(shuō)明可能有成纖維細(xì)胞浸潤(rùn)。H&E染色顯示皮下植入物周?chē)难装Y反應(yīng)消退，4周后未發(fā)生肉芽腫，表明所有水凝膠均未引起明顯的局部毒性，并顯示出良好的組織相容性【3】。

圖7. HE染色顯示，在大鼠皮下植入后 1、2 和 4 周，組織對(duì)hPM (A-C) 和膠原蛋白I水凝膠(D-F) 的反應(yīng)的組織學(xué)表現(xiàn)。比例尺=200 μm【3】

總結(jié)

小鼠腫瘤細(xì)胞衍生的 Matrigel方便購(gòu)買(mǎi)且易于使用，支持類(lèi)器官生長(zhǎng)和擴(kuò)增。然而，Matrigel的來(lái)源限制了類(lèi)器官在細(xì)胞治療或組織工程應(yīng)用中的直接臨床轉(zhuǎn)化。顯然需要一種根據(jù)GMP指南生產(chǎn)的水凝膠替代品。這種替代方案還必須保證類(lèi)器官的培養(yǎng)和大規(guī)模擴(kuò)增。相關(guān)數(shù)據(jù)表明，人源ECM水凝膠是用于大規(guī)模培養(yǎng)類(lèi)器官的潛在選擇，可能釋放類(lèi)器官的巨大臨床潛力，推動(dòng)臨床研究中血管生成技術(shù)的進(jìn)步。

參考文獻(xiàn)

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