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實(shí)驗(yàn)背景

細(xì)胞三磷酸腺苷(ATP)的產(chǎn)生速率是一種描述細(xì)胞代謝的信息含量很高的測(cè)量，因?yàn)?/span>

ATP是細(xì)胞內(nèi)普遍存在的主要能量貨幣。細(xì)胞的代謝調(diào)控使細(xì)胞根據(jù)ATP需求的變化調(diào)整ATP產(chǎn)生的變化來維持總的細(xì)胞內(nèi)的ATP水平。

  安捷倫Seahorse XF實(shí)時(shí)ATP速率測(cè)定被設(shè)計(jì)用來測(cè)量活細(xì)胞總的ATP產(chǎn)生速率。更重要的是，這個(gè)實(shí)驗(yàn)?zāi)軌騾^(qū)分哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)兩條主要的產(chǎn)生ATP的代謝途徑線粒體氧化磷酸化（OXPHOS）和糖酵解ATP的產(chǎn)生。

     Seahorse XF實(shí)時(shí)ATP速率測(cè)定利用代謝的調(diào)節(jié)劑（寡霉素（Oligomycin），魚藤酮（Rotenone）及kang霉素A（Antimycin A）的混合物，見圖1），當(dāng)連續(xù)加藥后，可以計(jì)算線粒體和糖酵解的ATP產(chǎn)生速率。配合Seahorse XFe24，XF96或XFe96分析儀，SeahorseXF實(shí)時(shí)ATP速率測(cè)定通過提供細(xì)胞ATP產(chǎn)生速率的實(shí)時(shí)測(cè)量和細(xì)胞能量平衡的定量表型為細(xì)胞生物能量學(xué)提供了一個(gè)新的動(dòng)態(tài)和定量的視角。

圖1. 安捷倫Seahorse XF實(shí)時(shí)ATP速率測(cè)定方案-OCR和ECAR測(cè)量的動(dòng)力學(xué)曲線。   首先測(cè)量基礎(chǔ)OCR和ECAR。加入寡霉素導(dǎo)致線粒體ATP合成受到抑制從而引起OCR減少，使mitoATP產(chǎn)生速率得以量化。ECAR數(shù)據(jù)結(jié)合檢測(cè)液的緩沖系數(shù)可以計(jì)算總的質(zhì)子流出速率（PER）。用魚藤酮和kang霉素A*抑制線粒體呼吸能夠計(jì)算線粒體相關(guān)的酸化，結(jié)合PER數(shù)據(jù)能夠計(jì)算glycoATP產(chǎn)生速率。

   哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，糖酵解和氧化磷酸化（OXOHOS）途徑提供大部分的細(xì)胞ATP。氧化磷酸化消耗O2，驅(qū)動(dòng)氧氣消耗速率（OCR），這兩條途徑都能導(dǎo)致檢測(cè)液酸化。葡萄糖通過糖酵解轉(zhuǎn)換成乳酸，每分子乳酸伴隨著一個(gè)H+流出，而TCA循環(huán)使ETC/氧化磷酸化產(chǎn)生CO2，也會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)液酸化。這些反應(yīng)的總和是細(xì)胞外酸化（ECAR）變化的主要驅(qū)動(dòng)因素。

詞匯表

· glycoATP產(chǎn)生速率(glycoATPProduction Rate)：糖酵解途徑中葡萄糖轉(zhuǎn)變成乳酸相關(guān)的ATP產(chǎn)生速率(以pmol ATP/min來表示)。

· mitoATP產(chǎn)生速率(mitoATPProduction Rate)：線粒體氧化磷酸化相關(guān)的ATP產(chǎn)生速率(以pmol ATP/min來表示)。

· 總的ATP產(chǎn)生速率(Total ATP Production Rate)：活細(xì)胞在適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)條件下線粒體ATP產(chǎn)生速率和糖酵解ATP產(chǎn)生速率之和。

· P/O值(P/O ratio)：一對(duì)電子通過線粒體電子傳遞鏈每還原一個(gè)氧原子(O)合成的ATP分子數(shù)(即磷酸化為ATP的ADP摩爾)。

· XF ATP速率指數(shù)(XF ATPRate Index)：在一定時(shí)間點(diǎn)，mitoATP產(chǎn)生速率除以glycoATP的比值。這是一個(gè)有價(jià)值的檢測(cè)代謝表型變化和/或差異的指標(biāo)。XF ATP速率指數(shù)的增加表示更多的氧化/更少的糖酵解表型，反之亦然。

· 誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)(Induced Assay)：XF實(shí)時(shí)ATP速率測(cè)定工作流程包含一次在連續(xù)注射寡霉素和魚藤酮/kang霉素A之前的實(shí)驗(yàn)化合物急性注射。此工作流程能夠測(cè)量ATP產(chǎn)生的原位激活或抑制，以及XF ATP速率指數(shù)(mitoATP產(chǎn)生速率/glycoATP產(chǎn)生速率)的實(shí)時(shí)改變。

· 緩沖系數(shù)(Buffer Factor)：測(cè)量系統(tǒng)的緩沖能力，包括檢測(cè)液和XF實(shí)驗(yàn)條件(儀器，探針，實(shí)驗(yàn)耗材)。

· 糖酵解(Glycolysis)：在Seahorse XF實(shí)驗(yàn)中，由葡萄糖轉(zhuǎn)變成乳酸的過程。

· 質(zhì)子流出速率(Proton Efflux Rate)：隨著時(shí)間的推移，細(xì)胞排出到檢測(cè)液中的質(zhì)子數(shù)，以pmol/min來表示。

· 糖酵解質(zhì)子流出速率(Glycolytic Proton Efflux Rate)：來源于糖酵解的質(zhì)子流出速率(扣除CO₂依賴的酸化的影響)。這個(gè)測(cè)量指標(biāo)與細(xì)胞外乳酸的產(chǎn)生速率高度相關(guān)。

· ATP偶聯(lián)的呼吸(ATP coupled respiration)：基礎(chǔ)呼吸中被用來驅(qū)動(dòng)ATP產(chǎn)生的部分。通過注射ATP合酶抑制劑寡霉素進(jìn)行定量。

 常見問題

§ 如果檢測(cè)液中含有不同的氧化底物（不同的P/O值），mitoATP產(chǎn)生速率如何計(jì)算？

    為了將ATP偶聯(lián)的呼吸轉(zhuǎn)換為線粒體的ATP產(chǎn)生速率，在電子傳遞鏈末端每還原一個(gè)氧原子，ADP磷酸化為ATP的化學(xué)計(jì)量學(xué)必須得到確定。不同的底物理論上大的P/O值不同，并且依賴于化學(xué)計(jì)量學(xué)/底物氧化通路，以及F₁F₀ ATP合酶的效率。在標(biāo)準(zhǔn)的XF實(shí)驗(yàn)條件下，細(xì)胞被供給底物混合物（主要是葡萄糖，丙酮酸和谷氨酰胺），且通常內(nèi)源性底物儲(chǔ)備（糖原，脂肪酸，其他氨基酸）可用于線粒體氧化。因此，用幾種細(xì)胞系進(jìn)行了測(cè)試并確認(rèn)P/O值2.75準(zhǔn)確代表了外源性和內(nèi)外源性氧化底物混合物的平均P/O值。

當(dāng)進(jìn)行誘導(dǎo)的XF實(shí)時(shí)ATP速率測(cè)定時(shí)，誘導(dǎo)的速率是如何計(jì)算和報(bào)告的？

     在XF實(shí)時(shí)ATP速率誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中Summary Printout和Measure Sheet中的 Average Assay Parameter Calculations顯示的Induced Rate(s)是用急性注射和寡霉素注射之間所有測(cè)量的平均值計(jì)算的。然而，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的誘導(dǎo)速率可以從Kinetic Rate Data（Measure Sheet）中獲得。

§ XF實(shí)時(shí)ATP速率測(cè)定中定義的XF ATP速率指數(shù)是什么？

    XF ATP速率指數(shù)是mitoATP產(chǎn)生速率與glycoATP產(chǎn)生速率的比值（即mitoATP rate/glycoATP rate）。這個(gè)比值是一個(gè)細(xì)胞代謝表型的定量指標(biāo)。代謝指數(shù)大于1代表大于50%的細(xì)胞ATP來自線粒體的ETC/氧化磷酸化，而指數(shù)小于1表示大于50%的總ATP是糖酵解途徑產(chǎn)生的。因?yàn)榇x指數(shù)是比值測(cè)量，所以它對(duì)于代謝表型的改變或轉(zhuǎn)換是高度敏感的。

§ 為什么相同的細(xì)胞類型當(dāng)細(xì)胞以不同的密度種板時(shí)XF ATP速率不一樣？

    細(xì)胞的代謝表型會(huì)被細(xì)胞對(duì)ATP的需求所影響。一般來說，處于增殖或分化中的細(xì)胞比融合（緩慢生長(zhǎng)）或末端分化的細(xì)胞擁有更高的糖酵解速率。為了比較實(shí)驗(yàn)之間的結(jié)果，推薦在整個(gè)研究過程中保持一致的細(xì)胞培養(yǎng)條件和細(xì)胞接種密度。

§ 為什么必須用Seahorse XF DMEM培養(yǎng)基，pH 7.4或Seahorse XF RPMI培養(yǎng)基，pH 7.4來進(jìn)行這個(gè)實(shí)驗(yàn)？

       GlycoATP產(chǎn)生速率的計(jì)算需要對(duì)XF實(shí)時(shí)ATP速率測(cè)定中的糖酵解質(zhì)子流出速率進(jìn)行測(cè)量。為了正確計(jì)算PER，檢測(cè)液必須要有一個(gè)固定的緩沖能力。培養(yǎng)基中低濃度的HEPES 在實(shí)驗(yàn)的時(shí)間范圍內(nèi)提供了一致的緩沖能力值。雖然添加HEPES緩沖液輕微地減少了ECAR信號(hào)，但是它顯著提高了ECAR數(shù)據(jù)的質(zhì)量和一致性，以及轉(zhuǎn)換為PER的準(zhǔn)確性（更多詳情，請(qǐng)參閱White paper: Improving Quantification of Cellular Glycolytic Rate Using Agilent Seahorse XF Technology）。此外，使用預(yù)調(diào)pH到7.4的XF DMEM或XF RPMI培養(yǎng)基節(jié)省了實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備的時(shí)間，確保XF實(shí)驗(yàn)過程中一致的檢測(cè)液pH值。

§ 我能夠使用其他的Seahorse XF檢測(cè)液來運(yùn)行XF實(shí)時(shí)ATP速率測(cè)定嗎？

   GlycoATP產(chǎn)生速率的準(zhǔn)確計(jì)算需要使用一種沒有酚紅和碳酸氫鈉且低濃度HEPES緩沖液的檢測(cè)液。因此，強(qiáng)烈推薦使用安捷倫Seahorse XF DMEM（或RPMI），pH 7.4的培養(yǎng)基。任何偏離推薦的培養(yǎng)基和補(bǔ)充劑（葡萄糖，丙酮酸鈉，谷氨酰胺），需要根據(jù)經(jīng)驗(yàn)（使用XF分析儀）確定每個(gè)實(shí)驗(yàn)的緩沖系數(shù)（參閱Seahorse XF Buffer Factor Protocol以進(jìn)一步了解信息）。任何含有酚紅的檢測(cè)液不能在XF實(shí)時(shí)ATP速率測(cè)定中使用。

§ 當(dāng)運(yùn)行誘導(dǎo)的XF實(shí)時(shí)ATP速率測(cè)定時(shí)，寡霉素注射之后的OCR高于基礎(chǔ)OCR，發(fā)生了什么？

     在寡霉素注射之前加入的化合物使電子傳遞與氧化磷酸化解偶聯(lián)（如FCCP，DNP等等），通常會(huì)導(dǎo)致OCR增加。然而，這種呼吸不與ATP的產(chǎn)生偶聯(lián)，因?yàn)闆]有ATP合酶的參與，線粒體膜電位會(huì)減少或消除，所以在這種環(huán)境下很少或沒有ATP生成。在這些情況下，基礎(chǔ)的mitoATP產(chǎn)生速率不能夠被準(zhǔn)確計(jì)算。如果懷疑存在解偶聯(lián)化合物，那么推薦添加一組對(duì)照組，注射檢測(cè)液+溶劑來計(jì)算基礎(chǔ)的mitoATP產(chǎn)生速率。